منبع مقاله درباره اندازه گیری، نرم افزار، رگرسیون

داده برداری کشت شدند. صفات مورد نظر عبارتند از تعداد روز تا شروع گلدهی ،تعداد روز تا متوسط گلدهی، تعداد روز تا پایان گلدهی، فاصله تا اولین شاخه فرعی، تعداد شاخه های جانبی، تعداد طبق در بوته ،ارتفاع کل، وزن صد دانه، و عملکرد در واحد بوته می باشند.
3-3 بررسی مولکولی ژنوتیپ های گلرنگ
3-3-1 استخراج DNA ژنومی
10 ژنوتیپ برای بررسی مولکولی با نشانگر ISSR مورد استفاده قرار گرفتند.در مرحله ساقه دهی (10-8 هفتگی ) برگها برای استخراج DNA مورد استفاده قرار گرفتند.برگها بلافاصله در ازت مایع قرار داده شدند.پس از انتقال به آزمایشگاه با ازت مایع پودر و در 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
3-3-2 اندازه گیری کمیت و کیفیت DNA
برای اندازه گیری کیفیت و کمیت DNA از دو روش اسپکتروفتومتری و الکتروفورز ژل آگارز استفاده شد.در روش اسپکتروفتومتری جذب نوری محلول نوری رقیق شده DNA (به صورت 15 میکرولیتر محلول استخراجی DNA +785 میکرولیتر TE ) در طول موج 260 نانومتر اندازه گیری شد. در این طول موج مقادیر DNA به صورت زیر محاسبه شد.
1OD= 50 ng/µl DNAدو رشته ای
در روش الکتروفورز ژل آگارز 4 میکرولیتر از هر یک از نمونه های DNA به همراه یک میکرولیتر بافر بارگیری بر روی ژل آگارز 5/1 درصد در بافر TBA (0/5X)به مدت یک ساعت با ولتاژ 75 ولت الکتروفورز شدند.سپس ژل با رنگ گرین ویوور رنگ آمیزی و عکس با استفاده از دستگاه UV ترانس ایلومیناتور مشاهده شد.
3-4 آغازگرهای ISSR
در این تحقیق 10 آغازگر از منابع فانگ و رز (1997) و ناگاوکا و اوگی هارا (1997) انتخاب شد. برای رسم دندروگرام آنالیز بوسیله باندهای حاصل از 5 پرایمر که تنوع خوبی داشتند انجام شد.مشخصات آغازگر ها در جدول( 3-1 )آمده است.
جدول ‏3–1:مشخصات آغاز گرهای ISSR مورد استفاده.
کد
نام آغازگر
توالی آغازگر
دمایاتصال(سانتیگراد)
1.

TCC)5RY-3′)5′-
6/57
2.
UBC810
5′-(GA)8 T – 3′
4/50
3.
UBC815
5′ – (CT) 8 G-3′
8/52
4.
UBC823
5′ – (TC) 8C-3′
8/52
5.
UBC841
5′ –(GA)8 YC-3′
56
R=A/T ، Y=G/C
3-5 انجام واکنش PCR
واکنش زنجیره ای پلیمراز در دستگاه ترموسایکلر مدل Biometra انجام شد. پس از تهیه محلول مادری و تقسیم آن بین میکروتیوپ ها ، در نهایت DNA ژنومی هر ژنوتیپ بین میکروتیوب ها اضافه شد و خوب به هم زده شد.سپس میکروتیوب های2/0میلی لیتری حاوی مخلوط واکنش (جدول 3-2 )دردستگاه ترموسایکلر قرار داده شد و طبق برنامه )جدول ،3-3) تکثیر گردید.
جدول ‏3–2: اجزاء مخلوط واکنش PCR برای تکثیر آغاز گرهای ISSR
ماده
غلظت
غلظت نهایی در واکنش
مقدار مصرف هر واکنش
بافر PCR
(10X )
X1
µl5/2
(Mgcl2)
mM25
µmol/l5/1
µl5/1
dNTPS
mM10
µmol/l200
µl5/0
آنزیم Taq
unit/µl5/0
Pmol2/0
µl1
آغازگر ها
Pmol10
Pmol1
µl1
DNA الگو
(40-30 نانو گرم )
آب مقطر استریل
µl3/18
حجم نهایی
µl25
جدول ‏3–3: برنامه چرخه حرارتی واکنش PCR برای تکثیر توسط آغازگرهای ISSR .
مرحله واکنش
زمان
دما(سانتیگراد )
تعداد سیکل
واسرشت سازی مقدماتی
2 دقیقه
94
1
واسرشت سازی
60 ثانیه
94
اتصال
60 ثانیه
50
45
بسط
2 دقیقه
72
بسط نهایی
10 دقیقه
72
1
3-6 الکتروفورز محصول PCR
محصولات PCR و بافر نمونه گذاری (6X) به نسبت 5 به 1 مخلوط گردید و روی ژل آگارز 2 درصد در بافر /5XTBE0با ولتاژ 100 ولت به مدت 5/2 ساعت الکتروفورز شد. رنگ آمیزی ژل با رنگ گرین ویوور انجام شد، و عکس برداری با دستگاه UV ترانس ایلومیناتور در شدت نور یکسان انجام شد.
برای تهیه محلول 10X TBE مقدار 6/21 گرم تریس را همراه با 11 گرم اسید بوریک در 150 میلی لیتر آب مقطر دیونیزه حل کرده و سپس 4 میلی لیتر از محلول pH=8 1M EDTA را به آن اضافه نموده و سپس با آب مقطر دیونیزه حجم محلول را به 200 میلی لیتر رسانیده شد.
برای تهیه محلول pH=8IM EDTA مقدار 612/18 گرم اتیلن دی سولفات تترااستات را وزن و 40 میلی لیتر آب مقطر به آن اضافه شد.محلول توسط یک همزن مغناطیسی به هم زده شد. سپس توسط سود pH محلول در حدود 8 تنظیم شد. در نهایت با آب مقطر حجم محلول به 50 میلی لیتر رسانیده شد.
3-7 آنالیز های آماری
تجزیه و تحلیل صفات مورفولوژیک توسط نرم افزار JMP4 انجام گرفت. داده های حاصل از آزمایش با استفاده از نرم افزار Diallel 98 وبراساس روش 2 گریفینگ (والدین و F1ها )،مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مقادیر ترکیب پذیری عمومی و خصوصی و برخی پارامترهای ژنتیکی مانند واریانس ترکیب پذیری عمومی و خصوصی ،و متوسط در جه غالبیت ،واریانس غالبیت، افزایشی ،میانگین کل هیبرید ها و والدین با این نرم افزار محاسبه شد.
برای برآورد هتروزیس از معادله های زیر استفاده شد:
F1-(P1+P2)/2 = هتروزیس نسبت به میانگین والدین (HMP)
والد برترF1- =هتروزیس نسبت به والد برتر (HHP)
3-8 آنالیز داده های مولکولی ISSR
امتیاز دهی باند ها و تجزیه و تحلیل اطلاعات DNA به این صورت انجام شد،که وجود باند با (1) و فقدان آن با (0) امتیاز دهی شد.سپس داده ها در Excel وارد و جهت تجزیه و تحلیل و رسم دندروگرام شباهت ژنتیکی به نرم افزار NTSYSPC2.2 منتقل و مورد تجزیه وتحلیل قرار گرفت. معمول ترین روش ها برای اندازه گیری فاصله ژنتیکی (GD) و تشابه ژنتیکی (GS) که برای داده های نشانگر های مولکولی بکار می روند عبارتند از:
ضریب نی و لی GDNL(1978)
ضریب جاکارد GDJ(1908)
ضریب تطابق سادهGDMR (1958)
فواصل ژنتیکی تخمین زده شده با استفاده از ضرایب بالا به صورت زیر محاسبه شدند.
GDNL=1-[2N11/(2N11+N01+N10)]
GDJ = 1-[N11/(N11+N10+N01)]
GDSM = 1-[(N11+N00)/(N11+N10+N01+N00)]
که در آنها N11تعداد باند یا آلل حاضر در هر دو عضو N00 تعداد باند یا الل غایب در هر دو عضو N10 تعداد باند حاضر تنهادر عضو i و N01 تعداد باند یا الل حاضر تنها در عضو j و N تعداد کل باند ها یا آلل ها می باشد.
4 فصل چهارم
نتایج و بحث
برای برآورد اثرات ژنها و نحوه کنترل ژنتیکی صفات مبادرت به تجزیه دای آلل به روش 2 گریفینگ شده است.وجود GCA و SCA معنی دار و مثبت(جدول 4-1) برای صفات نشان از آن دارد که اثرات افزایشی و غیر افزایشی تواماً در کنترل این صفات نقش دارند . نتایج جاصل با مطالعه (سانیتا و همکاران، 2013) مطابقت دارد.با توجه نقطه تقاطع بین خط رگرسیون و نمودار کواریانس نتاج – والدو مقادیر درجه غالبیت برای صفات مختلف نوع غالبیت مشخص می گردد. با توجه به پراکنش والدین نسبت به مبدا مختصات در نمودار کواریانس نتاج –والد نشان داده می شود والدینی که فاصله کمتری نسبت به مبدا مختصات دارند بیشترین ژنهای غالب و والدینی که بیشترین فاصله را تا مبدا مختصات دارند دارای بیشترین ژنهای مغلوب می باشند .مقادیر ترکیب پذیری عمومی بدست آمده نشان داده است که والدین P4 ، P5 و P7 ترکیب پذیری خوبی برای صفات مختلف دارند و می توان در برنامه های اصلاحی برای انتقال صفات از این والدین استفاده کرد.بررسی همبستگی بین فاصله ژنتیکی بدست آمده بر اساس مارکر های ISSR و میزان هتروزیس مشاهده شده در هیبرید ها نشان داد برای اکثر صفات رابطه مثبت و معنی داری وجود ندارد.
4-1 تعداد روز تا شروع گلدهی
نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اثر ترکیب پذیری عمومی(GCA) و خصوصی (SCA ) برای صفت تعداد روز تا شروع گلدهی درسطح آماری5/0و1درصد معنی دار است ( جدول 4-1) که نشان از نقش توام اثرات افزایشی و غیر افزایشی در کنترل این صفت دارد.همچنین معنی دار شدن نسبت GCA/SCA ( جدول4-1) ، نشان می دهد که سهم اثرات افزایشی نیز در کنترل این صفات قابل توجه است.با توجه به قطع شدن نمودار Wr (کواریانس نتاج با والد مشترکشان ) در قسمت زیر منحنی بوسیله خط رگرسیون و مقدار درجه غالبیت 43/1 (جدول 4-3) صفت بیشترتحت کنترل اثرات فوق غالبیت قرار دارد.
مقادیر GCA نشان داد لاینهای P10 و P5 به ترتیب بیشترین تاثیر را در افزایش و کاهش تعداد روز تا شروع گلدهی داشتند (جدول 4-2).بنابراین از والد P5 می توان برای انتقال صفت زود رسی به ژنوتیپهای مورد نظر استفاده کرد. اما والد P10 در افزایش تعداد روز تا شروع گلدهی بیشترین نقش را دارد و صفت دیررسی را به نتاج منتقل می کند.
نتایج SCA حاکی از این بود که تلاقی هایP4*P3 ،و P4*P10 ، به ترتیب بیشترین و کمترین تعداد روز تا شروع گلدهی را دارند.بنابراین می توان تلاقی های P4*P10را به عنوان زود رس ترین هیبرید در بین تلاقی ها معرفی کرد که دارای کمترین تعداد روز تا شروع گلدهی می باشد.
میانگین کل هیبرید ها و والدین به ترتیب 14/65 و33/66 می باشد که نشان دهنده 11% هتروزیس کل برای این صفت می باشد(جدول4-3). بیشترین میزان هتروزیس نسبت به والد برتر در تلاقی P3*P4 ، و کمترین هتروزیس نسبت به والد برتر در تلاقی P2*P3 مشاهده شد(جدول4-2).
با توجه به نحوه پراکنش والدین در اطراف مبدا مختصات مشخص می گردد که والدP2،P6و P10 دارای بیشترین ژنهای مغلوب می باشد در والد P5بیشترین ژنهای کنترل کننده صفت از نوع غالب می باشد.
شکل ‏4–1: خط رگرسیونWr-Vrبرای صفت تعداد روز تا شروع گلدهی Wr=aVr+b، Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا P10می باشند.
جدول ‏4–1 :خلاصه تجزیه واریانس صفات بر اساس روش 2 گریفینگ در تلاقی دای آلل لاین های اینبرد گلرنگ.
میانگین مربعات
منابع تغییرات
درجه آزادی
تعداد روز تا شروع گلدهی
تعداد روز تا متوسط گلدهی
تعداد روز تا پایان گلدهی
ارتفاع تا اولین شاخه فرعی
تعداد شاخه فرعی
GCA
9
29/39**
93/19**
74/27**
55/118**
23/14**
SCA
35
01/23**
12/10**
32/18**
29/182**
29/13**
Error
88
49/1
02/2
51/1
39/0
65/0
GCA/SCA
70/1**
96/1**
50/1**
65/0**
07/1**
-ns ، * و ** به ترتیب عدم معنی داری ،معنی داری در سطح احتمال 5 و 1 درصد
ادامه جدول 4-1.
میانگین مربعات
منابع تغییرات
درجه آزادی
تعدادطبق در بوته
وزن صد دانه
ارتفاع کل
عملکرد در واحدبوته
GCA
9
05/296**
**00/1
01/231**
39/225**
SCA
35
38/193**
**35/0
85/101**
83/336**
Error
88
39/1
05/0
79/0
21/0
GCA/SCA
53/1**
85/2**
26/2**
66/0**
4-2 تعداد روز تا متوسط گلدهی
نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اثر ترکیب پذیری عمومی(GCA) و خصوصی (SCA )درهر دو سطح آماری 5/0 و 1 درصد معنی دار است،بنابراین هر دونوع اثرات افزایشی و غیر افزایشی در کنترل این صفت نقش دارند.نسبت GCA/SCA ( جدول4-1) برای این صفت معنی دار است که نشان از موثر بودن اثرات افزایشی در کنترل این صفت دارد.
متوسط درجه غالبیت 20/1 جدول (3-4) می باشد که وجود اثرات

مطلب مرتبط :   منبع پایان نامه ارشد درموردسلسله مراتبی، سلسله مراتب، خوشه بندی

دیدگاهتان را بنویسید