ارزیابی میزان مس، روی و منگنز در سرم، کبد و استخوان موشهای صحرایی نر تغذیه شده با نان غنی شده با آهن و بررسی ارتباط آنها با شاخص های استرس اکسیداتیو- قسمت ۱۳

آوریل 8, 2021 0 Comments

نمونه/ کالیبراتور

 

 

 

 

۲۵میکرولیتر

 

 

۲۵میکرولیتر

 

 

 

معرف

 

 

۱۰۰۰میکرولیتر

 

 

۱۰۰۰میکرولیتر

 

 

۱۰۰۰میکرولیتر

 

 

 

مخلوط کرده، ۱۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد انکوبه نمایید و جذب نوری نمونه ( sample) و کالیبراتور (A Calibrator) را در طول موج ۵۰۰ ناتومتر مقابل بلانک معرف، پایداری رنگ ۳۰ دقیقه می­باشد.

 

 

محاسبه:
در سرم پلاسما:
Uric acid(mg/dl)=Cal. Cinc.
۳-۱۲-اندازه ­گیری کل ظرفیت اتصال به آهن (TIBC)
ظرفیت کل اتصال به آهن با روش دستی و کیت شرکت درمان کاو انجام شد.
اصول متد:
تعیین TIBC در حقیقیت اندازه ­گیری غیر مستقیم غلظت ترانسفرین خون است. برای این منظور به سرم مورد آزمایش یون آزمایش یون آهن افزوده می­ شود تا تمام جایگاه­های موجود در ترانسفرین از آهن اشباع گردد. سپس اضافی آهن با کربنات منیزیم از محیط عمل خارج می­گردد کل آهن پیوند شده به ترانسفرین اندازه ­گیری شود.
معرف­ها:
۱٫محلول آهن ml55
۲٫پودر کربنات منیزیم g3
طرز کار :
در یک لوله آزمایش ml 5/ سرم ریخته به آن ml 1 از محلول آهن (شماره :۱) اضافه نمایید. محتویات لوله را مخلوط نموده و ۵ دقیقه در حرارت آزمایشگاه به حال خود بگذارنید. سپس یک قاشقک سر صاف (حدود ۵۰ میلی­گرم) کربنات منیزیم (شماره ۲) را به داخل لوله افزوده و با ورتکس به شدت مخلوط نمایید و مدت ۳۰ دقیقه در حرارت آزمایشگاه قرار دهید. در این مدت هر ۵ دقیقه یک بار لوله را تکان دهید. پس از این مدت لوله را با دور rpm 3500 برای مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ نمایید و از صاف شده ml 5/ برداشته و مقدار آهن آنرا ترجیحاً با کیت آهن درمانکاو اندازه ­گیری نمایید.
روش محاسبه:
TIBC (μg/dl)=مقدار آهن (g/dμ)
UIBC= TIBC-Serum Iron
۳-۱۳-اندازه ­گیری ظرفیت تام آنتی اکسیدانی
سرم با روش شیمیایی استفاده از کیت اندازه گیری TAC شرکت بایرکس فارس بر مبنای روش کار استخراج شده از شرکت رندوکس ایرلند اندازه ­گیری شد.
اصول آزمایش
تعیین ظرفیت کل آنتی­اکسیدانی بر اساس واکنش پراکسید با پراکسیداز پایه­گذاری شده که به متابعت با یک واکنش رنگی که از رنگ­پذیری ماده­ی تترامتیل بنزیدین می­باشد. رنگ آبی آن بعد از اضافه کردن محلول پایان به رنگ زرد تبدیل می­ شود و می­توان آن را با دستگاه جذب نوری در طول موج ۴۵۰ نانومتر اندازه گرفت. (به طور متناوب اندازه ­گیری کینتیک در ۶۰۰ نانومتر امکان­ پذیر است اگر نقطه­ی پایانی اندازه ­گیری لازم نباشد). در رابطه بن نقطه­ی پایان اندازه ­گیری (استفاده از محلول توقف) با جذب ۴۵۰ نانومتری شبیه سرم­های نمونه­برداری شده می­باشد که باید به وسیله­ کاهش جذب درونی مورد آزمایش واقع شده باشند. کمیت با رقت­سازی محلول آنتی­اکسیدان استاندارد به دست آمده است.
مواد اضافی و تجهیزات مورد نیاز که در کیت آماده نشده ­اند
صحت درجه­بندی میکروپیپت را تنظیم کنید (به عنوان مثال ۱۰۰-۱۰ میکرولیتر / ۱۰۰۰-۱۰۰ میکرولیتر)، دستگاه الیزا که قادر باشد جذب را در ۴۵۰ نانومتر بخواند، دستگاه ورتکس، آب مقطر
نمونه­های جمع شده و ذخیره شده­
سرم و پلاسمای EDTAدار
نمونه­های سرم آماده شده و پلاسمای EDTAدار الزامی هستند. از نمونه­هایی که به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق نگه داشته شده ­اند استفاده نکنید. نمونه­های همولیزی و چربی­دار نباید در آزمایش استفاده شود. نمونه­ها به مدت ۳۶ ساعت در دمای ۸-۲ درجه می توانند ذخیره شوند. برای یک مدت طولانی (بیشتر از ۲ هفته نمونه­ها باید در دمای ۲۰- درجه­ سانتی ­گراد ذخیره شوند).
پروتئین­های بزرگ می­توانند با دستگاه سانتریفیوژ از نمونه خارج شوند (برای مدت ۵ دقیقه در ئور g 10000 ). پلاسمای هپارینه و خون نمی­توانند برای این آزمایش استفاده شوند.
انجام آزمایش
قبل از استفاده همه­ی مواد را در دمای اتاق بگذارید و انها را مخلوط کنید، توصیه می­ شود دو برابر کار کنید.
آماده کردن مواد
ترکیب شناساگر A
۱۰ میلی­لیتر از ماده­بافر و ۱۰ میکرو­لیتر از محلول پراکسید را ترکیب کنید (برای تشخیص ۹۶ درصدی کافی است).
ترکیب شناساگر B
۵ میلی­لیتر از ماده­ی بافر و ۵۰ میکرو­لیتر از substrate و ۵ میکرو­لیتر از پراکسیداز را ترکیب کنید(برای تشخیص ۹۶ درصدی کافی است).
آزمایش TAC
۱٫ ۲۵ میلی­لیتر از محلول استاندارد را بردارید و کنترل و نمونه­ها را با دقت درون خانه­های میکروتیتر پلت بریزید
۲٫ ۱۰۰ میکرو­لیتر از محلول شناساگر A را بردارید و به داخل خانه­ها بریزید. برداشتن و ریختن درون خانه­ها بیشتر از ۱ دقیقه طول نکشد.
۳٫ ۵۰ میکرولیتر از محلول شناساگر B را بردارید و داخل خانه­ها بریزید.
۴٫ دقیقا برای مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۸-۲ درجه­ سانتی گراد گرم­خانه­گذاری کنید.
۵٫ ۵۰ میکرولیتر از محلول پایان را درون هر خانه بریزید ( بیشتر از ۱ دقیقه طول نکشد).
۶٫ دستگاه میکروپلت خوان را در ۴۵۰ نانومتر تنظیم کرده و جذب محلول در خانه­ها را بخوانید.
محاسبه­ نتیجه
پس از تعیین میزان جذب نوری و ترسیم منحنی استاندارد غلظت TAC بر حسب میلی مول در لیتر محاسبه شد.
۳-۱۴-اندازه ­گیری فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز
این آنزیم توسط کیت رانسود[۱۰۶] بر اساس روش مربوطه ( مک کورد و فریدوویچ، ۱۹۶۹) اندازه ­گیری شد.
اساس روش کار:
نقش آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD) خنثی کردن رادیکال های سمی سوپراکسید تولید شده طی واکنش­های انرژی­زای اکسیداتیو و تبدیل آن­ها به هیدروژن پراکسید و اکسیژن مولکولی
می­باشد. در این روش، از گزانتین[۱۰۷] و گزانتین اکسیداز[۱۰۸] (XOD) برای تولید رادیکال­های سوپراکسید استفاده می­گردد. این رادیکال­های تولید شده با ماده­ای موسوم به آی. ان. تی. (INT) (2-4-یدوفنیل-۳- ۴- نیتروفنول- ۵- فنیل تترازولیوم کلراید) که در کیت موجود می­باشد، واکنش داده و ماده قرمز رنگی موسوم به فرمازان[۱۰۹]، تولید می­ کند. سپس میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز از طریق اندازه ­گیری درصد مهار انجام واکنش تعیین می­گردد. یک واحد از آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز، مقدار آنزیمی است که توانایی مهار ۵۰ درصد از سرعت احیاء ماده آی. ان. تی. را در شرایط آزمایش دارد.
روش تهیه نمونه :
ابتدا ۵/۰ میلی­لیتر از نمونه خون هپارینه یا EDTA دار را در دور ۳۰۰۰، به مدت ۱۰ دقیقه، سانتریفیوژ نموده و پلاسمای نمونه را جدا می­کنیم. سپس گلبول­های قرمز را ۴ بار شستشو
می­دهیم. روش شستشو به این صورت است که گلبول­های قرمز را با ۳ میلی­لیتر محلول سدیم کلراید ۹/۰ درصد مخلوط کرده و سپس ۱۰ دقیقه در دور ۳۰۰۰ سانتریفیوژ می­کنیم. پس از اتمام شستشوی گلبول­های قرمز، به گلبول­های شسته شده، ۲ میلی­لیتر آب مقطر سرد اضافه کرده و خوب مخلوط می­نمائیم و سپس به مدت ۱۵ دقیقه، در دمای ۴ درجه سانتی ­گراد قرار می­دهیم. این کار باعث لایز شدن گلبول­های قرمز می­گردد. سپس محلول حاصل را با بهره گرفتن از بافر فسفات ۰۱/۰ مولار با اسیدیته ۷، ۵۰ بار رقیق می­نماییم (که در اینجا فاکتور رقت کل را به ۲۰۰ می­رسانیم). این کار درصد مهار آنزیم را به میزانی بین ۳۰ تا ۶۰ درصد می­رساند.
آماده ­سازی معرف­ها
کیت شرکت راندوکس برای اندازه ­گیری سوپراکسید دیسموتاز، حاوی ۴ نوع معرف به شرح زیر می باشد:
معرف شماره یک یا سوبسترای مخلوط :
محتوی ۰۵/۰ میلی­مول بر لیتر از ماده گزانتین و ۰۲۵/۰ میلی­مول بر لیتر از ماده آی. ان. تی.
معرف شماره دو یا بافر :
محتوی۴۰ میلی مول بر لیتر از ماده سی. ای. پی. اس (CAPS) با اسیدیته ۲/۱۰ و ۹۴/۰ میلی مول بر لیتر از ماده EDTA.

 

برای

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *