استاندارد و انتخابی

دانلود پایان نامه

تکثیر نهایی 72 5 دقیقه 1
2-9- الکتروفورز:
الکتروفورز در ژل یک روش استاندارد جهت جداسازی مولکولهای DNA با اندازه های مختلف است. این روش کاربردهای بسیاری در ارزیابی قطعاتDNA دارد، همچنین می تواند برای جداسازی مولکولهای RNA نیز مورد استفاده قرار گیرد. الکتروفورز حرکت مولکولهای باردار در میدان الکتریکی است، مولکولهای دارای بار منفی به سمت الکترود مثبت و مولکولهای دارای بار مثبت به سمت الکترود منفی حرکت می کنند. دو نوع ژل در بیولوژی مولکولی کاربرد دارند که شامل ژل پلی آکریل آمید(PAGE) و ژل آگارز می شوند (22). در این مطالعه به الکتروفورز در ژل آگارز می پردازیم.
2-9-1- الکتروفورز بر روی ژل آگارز :
آگارز در واقع پلیمری پلی‌ساکاریدی می باشد، که از نوعی جلبک قرمز دریایی استخراج می‌شود. ترکیب خالص این ماده پودر سفید رنگ بی بو و بی مزه ای است که قابلیت جذب آب فراوان دارد. این ترکیب در آب سرد نامحلول بوده و ترکیب کلوئیدی ایجاد می کند. افزایش دمای این محلول کلوئیدی نهایتاً موجب انحلال کامل آگارز می شود، سرد شدن مجدد مجموعه، با ایجاد باندهای هیدروژنی بین زنجیره‌های پلیمری شبکه‌ای با چگالی بسیار بالا ایجاد خواهد کرد. چنین بستری زمینه انتخابی برای جداسازی ملکول های اسید نوکلئیک را به راحتی فراهم می نماید. حرکت مولکول‌های اسیدنوکلئیک قرار گرفته در چنین ساختاری از طریق منافذ ایجاد شده در آن است، بنابراین مولکول‌های کوچک‌تر راحت‌تر و سریع‌تر از لابه لای منافذ عبور کرده و در بستر ژل حرکت می کنند. تفاوت در سرعت حرکت ملکول های اسیدنوکلئیک قرار گرفته در زمینه ژل که به سبب تفاوت موجود در اندازه آنها ایجاد شده، نهایتاً موجب جداسازی آنها از هم می گردد (66).
مطلب مرتبط :   پایان نامه تجزیه واریانس و مقایسه

جستجو در سایت ما :


SYBER Gold یکی از رنگ‌هایی است که برای مشاهده‌ مستقیم مقادیر بسیار کم DNA مورد استفاده قرار می گیرد. این رنگ دارای ترکیب فلورسانس می باشد و در صورت قرار گرفتن در معرض نور ماورای بنفش برانگیخته شده و می درخشد. این ترکیب در مرحله ریختن محصول PCR به درون چاهک با آن مخلوط می شود.
2-9-2- مواد مورد نیاز برای الکتروفورز با ژل آگارز :
: Invitrogen SYBER Gold nucleic acid gel stain طرز تهیه رنگ
4 میلی لیتر SYBER Gold
500 میلی لیتر Loader buffer
500 میلی لیتر DMSO
محلول های فوق را با هم مخلوط کرده، سپس آن را ورتکس می کنیم.
طرز تهیه بافر(5X) TBE :
27 گرم تریس پایه (Tris base)
75/13 گرم بوریک اسید
10 میلی لیتر EDTA 5/0 مولار (PH=8)
مواد فوق را با افزودن آب مقطر به حجم cc500 رسانده و هنگام مصرف در الکتروفورز و تهیه ژل، بسته به اندازه حجم مورد نظر آن را رقیق می کنیم.
2-10- الکتروفورز ژل آگارز بر روی محصولات PCR مورد مطالعه :
جهت انجام الکتروفورز بر روی محصولات PCR مورد مطالعه، ژل آگارز 2% به روش زیر تهیه شد: ابتدا Casting plate را روی سطحی کاملاً تراز قرار داده و شانه را به موازات یکی از اضلاع آن به گونه ای قرار می دهیم که همه دندانه‌هایش با فاصله یکسان از کف در یک سطح قرار گرفته باشند. استفاده از یک سطح شیب دار در این مرحله موجب ایجاد اختلاف سطح در بخش های مختلف ژل و نهایتاً عدم توزیع یکنواخت نیروی الکتریکی در آن می شود. آنالیز نتیجه نهایی چنین واکنشی به دور از خطا نبوده و قابل اعتماد نیست.
در مرحله بعدی 5/1گرم آگارز را با cc 75، بافر TBE ( 1X)، مخلوط کرده و در ماکروویو قرار می-دهیم تا تمام بلورهای آگارز موجود در بافر حل شود. محلول یکنواخت شفاف و عاری از حباب حاصل را مدتی در دمای اتاق قرار می دهیم تا دمای آن به حدود 55- 45 درجه سانتی‌گراد برسد. آگارز مایع حاصل را به آرامی از یک گوشه به گونه ای داخل‌ Casting plate می ریزیم که کوچک‌ترین حبابی در سطح آن ایجاد نشود. سپس اجازه می‌دهیم تا پلیمریزاسیون کامل ژل در دمای اتاق صورت گرفته و ژل آگارز به طور کامل ببندد. شانه را با احتیاط از درون ژل کاملاً بسته شده خارج کرده، ژل را همراه با قالب به تانک الکتروفورز حاوی مقدار کافی بافر TBE 1x تمیز انتقال می‌دهیم. سپس 5 میکرولیتر محصول PCR را با 2 میکرولیتر مخلوط محلول رنگ Syber gold)، Loader buffer و (DMSOکه توضیح داده شد، پیپتینگ کرده و درون چاهک ها می ریزیم. در اولین چاهک نیز DNA ladder ریخته و در نهایت تانک را به منبع تغذیه متصل کرده به طوری که جریان از قطب منفی به مثبت انجام پذیرد. به این ترتیب، محصولات PCR به مدت 30 دقیقه و با ولتاژ 85 ولت الکتروفورز می شوند.
2-11- عکس برداری از ژل:
پس از انجام مراحل فوق، با استفاده از دستگاه UV transdocumenter به طور مستقیم از ژل عکس گرفته می شود، سپس وضعیت قطعات DNA انتقال یافته بر روی ژل مورد بررسی قرار می- گیرد.