اندازه گیری و درجه حرارت

دانلود پایان نامه

11. به منظور خارج شدن کامل اتانل موجود در بافر W2 نمونهها یک بار دیگر به مدت 1 دقیقه با دور rpm 12000 سانتریفوژ گردند.
12. جهت رقیقسازی نمونهها، Binding column به تیوب 5/1 استریل جدید منتقل میگردد. 200 میکرولیتر بافر TE یا nuclease free water به آنها اضافه شده و مدت 1 دقیقه در دمای اتاق قرار داده میشوند.
13. نمونهها به مدت 1 دقیقه با دور rpm 8000 سانتریفوژ میشوند.


2-4- بررسی کیفیت و کمیت ژنوم استخراج شده :
قبل از انجام هر PCR، لازم است که کیفیت و کمیت DNA تخلیص شده مورد بررسی قرار گیرد. برای تعیین کیفیت و کمیت DNA می توان از دستگاه اسپکتروفتومتر نانودراپ و یا برای تعیین کیفیت DNA می توان از روش الکتروفورز ژل آگارز عمل کرد. در این مطالعه از هر دو روش برای سنجش کیفیت و کمیت DNA استفاده شد؛ هر کدام این روش ها در ذیل آمده است.
2-4-1- تعیین کیفیت و کمیت ژنوم با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر نانودراپ :
معمول‌ترین روش جهت تعیین غلظت DNA، استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر است. با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر معمولی جذب محلول رقیق شده DNA در طول موج 260 نانومتر (طول موج جذب اسیدهای نوکلئیک) و 280 نانومتر (طول موج جذب پروتئین ها) اندازگیری و در نهایت نسبت جذب نوری محلول های DNA در طول موج 260 به 280 نانومتر (280/260=r) که شاخص میزان خلوص DNA می باشد، بدست می آید. این نسبت باید بین 8/1 تا 2 باشد. اگر نسبت کوچک‌تر از 8/1 باشد، آلودگی DNA را با پروتئین نشان می‌دهد و نسبت بزرگ‌تر از 2 به دلیل وجود RNA در نمونه می باشد. از تقسیم جذب نوری (OD ) در طول موج 260 نانومتر به جذب نوری در طول موج 280 نانومتر، میزان خلوص نمونه‌یDNA ، بدست می آید؛ همچنین جهت تعیین میزان غلظت DNA از فرمول زیر استفاده می شود.
ضریب رقّت * 50 * مقدار جذب در nm260 = غلظتDNA (بر حسب نانوگرم بر میکرولیتر)
برای بررسی کمیت وکیفیت نمونه های تخلیص شده در این پژوهش از دستگاه اسپکتروفتومتر نانودراپ استفاده شد. این دستگاه تنها با استفاده از 1 الی 2 میکرولیتر از نمونه قادر است در زمانی کمتر از 10 ثانیه کلیه طول موجهای موجود در طیف مورد نظر را با دقت 1 نانومتر، اسکن نماید و غلظت یا جذب نوری ماده مورد نظر را نیز تعیین کند. با توجه به سرعت بسیار بالای دستگاه و میزان کم نمونه مصرفی، کاربران این دستگاه قادر خواهند بود ضمن صرفه جویی در زمان و هزینه، بسیاری از آزمایشات ژنومیکس، پروتئومیکس و بیوشیمی را کنترل کیفی و بهینه نمایند. یکی از ویژگی های این دستگاه اندازه گیری و تعیین غلظت DNA در حجم یک میکرولیتر بدون احتیاج به رقیق سازی نمونه می باشد (79).
مطلب مرتبط :   پایان نامه ارشد رایگان درمورد ابتلا به بیماری و عوامل محیطی

جستجو در سایت ما :


میانگین غلظت DNA در این پژوهش 225 نانوگرم بر میکرولیتر و میزان خلوص آن 86/1 نانومتر بدست آمد.
2-4-2- تعیین میزان کیفیت ژنوم با استفاده از الکتروفورز :
به منظور کیفیت سنجی DNA استخراج شده، از دستگاه الکتروفورز نیز استفاده شد. در این روش، میزان خرد شدگی DNA تخلیص شده، بر حسب گستره ای که پس از الکتروفورز DNA بر روی ژل باقی می ماند تعیین می گردد. جهت تعیین کیفیت DNA استخراج شده، میزان μl4 از محلول حاوی DNA را به همراه μl2 مخلوط محلول رنگ Syber gold)، Loader buffer و (DMSOکه قبلاً تهیه کرده ایم پیپتینگ می کنیم سپس آن را بر روی ژل آگارز 1% و به مدت یک ساعت با ولتاژ 80 ولت، الکتروفورز نموده؛ در انتها به وسیله دستگاه UV transdocumenter به طور مستقیم از ژل عکس می گیریم. عکس زیر نمونه ای از الکتروفورز ژل آگارز DNA را نشان می دهد.

شکل(2-1): الکتروفورز ژل آگارز DNA
2-5- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) :
واکنش PCR که هدف آن تکثیر انتخابی جایگاه مشخصی از کل ژنوم موجود در محیط واکنش است، در سال 1983 توسط کری مولیس ابداع شد.
در طی این واکنش دمای بالا (°C94) جانشین عدم حضور آنزیم های توپوایزومراز ضروری برای جداسازی موقت دو رشته DNA از هم گردیده است. آنزیم DNA پلیمراز استخراج شده از باکتری ترموس‌آکواتی‌کوس ، یکی از آنزیم های کاندیدی است که به دلیل قابلیت تحمل حرارت بالا مورد توجه بسیاری از محققین نیازمند بکارگیری PCR قرار گرفته است. اساس واکنشPCR، تکثیر یک جایگاه خاص است که معمولاً شامل تکرار چرخشی30-25 مرتبه ای سه مرحله ی 1) جداسازی دو رشته الگو از هم در نتیجه حرارت بالای موجود در محیط، 2) اتصال آغازگرها به الگوی مکملشان و 3) تکمیل توالی طی عملکرد DNA پلیمراز می باشد، که به ترتیب تحت نام های Denaturing، Annealing و Extension ذکر می شوند؛ نتیجه نهایی PCR دستیابی به کپی های چند صد میلیونی از جایگاه مد نظر است (23).
2-5-1- مراحل PCR :
همانطور که پیشتر عنوان شد؛ هر واکنش PCR در عمل تکرار چرخشی سه مرحله Denaturation ، Annealing و Extentionمی باشد، که مورد بررسی اجمالی قرار می گیرد.
دمای واسرشته سازی ( Denaturation):
انجام پلیمریزاسیون DNA، مستلزم جدا شدن دو رشته دایمر آن از هم است. وجود آنزیم های توپوایزومراز و هلیکاز به همراه ترکیبات پروتئینی در شرایط طبیعی واکنش جداسازی دو رشته DNA را از هم کاتالیز می کنند. درجه حرارت °C94 در واکنش PCR جایگزین استفاده از این آنزیم ها می شود. در این دما پیوندهای هیدروژنی بین پلی نوکلئیک های مارپیچ دوگانه شکسته شده، DNA هدف، دناتوره و تک رشته ای می شود.
دمای اتصال (Annealing) :