مقاله مکان بهینه و درجه حرارت

دانلود پایان نامه

1-5-2- مزایا

جستجو در سایت ما :


این روش بر مبنای فلوروسنت  تولیدی از مولکول گزارشگرمیباشد که در طول واکنش افزایش می یابدو مزایایی نسبت به PCR معمولی دارد :
قابل مشاهده تکثیر در هر زمان.
امکان بهینهسازی واکنش. به گونهای که مناسبترین غلظت DNA،پرایمر و همچنین تعداد سیکل لازم برای تکثیر مشخص میشود.
امکان قطع واکنش در زمان دلخواه.
آنالیزPCR کمی با استفاده از روش سنجش مطلق و سنجش نسبی و اندازهگیری میزان دقیق و نسبی الگوی اولیه.
سرعت بالای واکنش و لزوم زمان کمتر.
بالاتر بودن محدوده تشخیص از PCR معمولی[26، 14،4].
1-5-3- مراحل اصلی
مراحل اصلی این واکنش،همان مراحل PCR معمولی است :
باز شدن دو رشته DNA از هم(واسرشتسازی)
اتصال آغازگرها(هیبریداسیون)
سنتز مولکول جدید(طویل شدن)[14, 4].
1-5-4- روشهای انجام این تکنیک
تشخیص غیر اختصاصی با استفاده از رنگ های متصل شونده بهDNAیا رنگهای اینترکاله
در اینروش از رنگهای متصلشونده به DNA به عنوان گزارشگر فلوروسنت برای مشاهده واکنش  PCRاستفاده میشود. این فلوروسنت در سیکل متوالی بر اثر مضاعف شدن افزایش مییابد. با ثبت مقدار فلوروسنت ساطع شده در سیکل،میتوان واکنش را در طول مرحله نمایی مشاهده نمود. از جمله رنگها به عنوان گزارشگر که مورد استفاده در این روش هستند،میتوان بهSYBR Greenاشاره کرد. نحوه عملکرد این رنگ به این صورت است که به شکاف کوچک مارپیچ دو رشتهای DNAباند میشود و با جذب طول موج nm498،نور nm522ساطع میکندکه توسط دستگاه ثبت میشود.SYBR Green،تحت شرایط PCR،پایدار باقی میماند. سطح مطلوبی از درجه حرارت موجب تنظیم القاء و نشر طول موج ها می شود. در داخل محلول, رنگهایی که به DNAباند نشدهاند،فلوروسنت خیلی کمی را نشان میدهند و فلوروسنت  زمانی به وضوح  افزایش می بابد که رنگ به DNA دو رشتهای متصل شود. در ضمن این رنگ به الگوهای تکرشتهای متصل نمیشود لذا در این موارد نیز بازتاب کمی دارند[26، 14،4].
شکل( 1-14) : مکانیسم عمل رنگ SYBR-Green طی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR).
در ابتدا در فاز Denaturation تمامی اجزا از هم جدا هستند و زمانی که مولکول DNA تک‌رشته‌ای است رنگ SG به آن اتصال نمی‌یابد،از این رو سیگنالی مشاهده نمی‌شود. اما در فاز Annealing در اثر اتصال آغازگرها به تدریج رنگ شروع به اتصال میکند. با شروع فاز Extention، وقتی که مولکول DNA وارد واکنش PCR شده و همانندسازی انجام می‌شود (DNA دو‌رشته‌ای)،اتصال رنگ SG به DNA شدّت یافته و در انتهای این فاز به اوج خود میرسد. بنابراین در انتهای هر سیکل به دلیل دو برابر شدن محصولات شدت سیگنال بالا میرود.
شکل( 1-14) : مکانیسم عمل رنگ SYBR-Green طی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR).
در ابتدا در فاز Denaturation تمامی اجزا از هم جدا هستند و زمانی که مولکول DNA تک‌رشته‌ای است رنگ SG به آن اتصال نمی‌یابد،از این رو سیگنالی مشاهده نمی‌شود. اما در فاز Annealing در اثر اتصال آغازگرها به تدریج رنگ شروع به اتصال میکند. با شروع فاز Extention، وقتی که مولکول DNA وارد واکنش PCR شده و همانندسازی انجام می‌شود (DNA دو‌رشته‌ای)،اتصال رنگ SG به DNA شدّت یافته و در انتهای این فاز به اوج خود میرسد. بنابراین در انتهای هر سیکل به دلیل دو برابر شدن محصولات شدت سیگنال بالا میرود.
رنگ اینترکالهSYBR Green،واجد 2 مزیّت عمده است که آن را به متداولترین رنگ مورد استفاده تبدیل کردهاست :
استفاده از این رنگ،بسیار کمهزینه است چون دیگر نیازی به طراحی شناساگراختصاصی و آغازگرهای جدید نیست و طراحی آزمایش به سهولت انجام میگیرد.
این رنگ،یک رنگ غیر اختصاصی است لذا برای تمامی آزمایشات قابل استفاده است.
این مسئله در واقع مهمترین عیب این رنگ نیز بهشمار میآید. چرا که این رنگ به همه مولکولهای دو رشتهای از جنسDNA متصّل میشود. این مولکولها میتوانند محصولات غیر اختصاصی و آغازگرهای جفتشده نیز باشند. بنابراین سیگنالهای فرستادهشده در دستگاه هم سیگنال هدف و هم سیگنال فرعی میباشند.در نتیجه در این روش،تمایز و تفاوت بین سیگنال هدف و سیگنال فرعی،ضروری است. البته استفاده از منحنی خاصّی به نام منحنی ذوب که در ادامه به آن اشاره خواهد شد،این مشکل را تا حدّی مرتفع کردهاست[26، 14،4].